혈액을 활용한 유방암 체외 정밀 진단시스템 개발
- 초정밀 고감도 엑소좀 RNA 측정을 통한 혈액 내 유방암 마커의 체외 진단시스템 개발
- 유방암 조기 진단 및 치료 효과 지속 추적으로 효과적인 치료 전략 개발 기대
국내 연구진이 형광 신호 증폭 탐침(probe)을 활용한 엑소좀(exosome) RNA 측정을 통해 혈액 내 유방암 바이오마커를 정밀 진단할 수 있는 시스템을 개발하였다. 이를 통해 혈액 검사로 유방암을 조기에 진단하고, 나아가 치료 모니터링을 통해 효과적인 암 치료 전략 개발에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.
한국생명공학연구원(이하 생명연) 바이오나노연구센터 임은경 박사(교신저자: 임은경 박사, 제1저자: 임재우 박사과정)와 연세대학교 화공생명공학과 함승주 교수팀(교신저자: 함승주 교수)이 공동으로 수행한 이번 연구는 과학기술정보통신부와 한국연구재단이 주관하는 바이오·의료기술개발사업, 원천기술개발사업, 글로벌프론티어 연구개발사업, 이공분야기초연구사업, 환경부의 환경기술개발사업, 산업통상자원부의 알키미스트 프로젝트, 과학기술연합대학원대학교의 UST Young scientist 양성사업, 한국생명공학연구원의 주요사업의 지원으로 수행되었고, 바이오센서 분야의 세계적 저널인 Biosensors and Bioelectronics(IF 10.257) 11월 1일자(한국시각 11월2일) 온라인 판에 게재되었다.
(논문명 : Microfluidic device for one-step detection of breast cancer-derived exosomal mRNA in blood using signal-amplifiable 3D nanostructure)
엑소좀은 세포로부터 배출되는 작은 지질 소포체로 모체가 되는 세포의 특성을 보유하고 있으며, 혈액, 소변, 눈물 등 다양한 체액에서 발견된다. 특히, 암세포로부터 발생한 엑소좀은 원발암(primary cancer, 암이 처음 발생한 장기의 암)에 대한 정보를 포함하고 있어 체액 기반의 암 진단 분야에서 주목받고 있다.
기존의 암 진단은 침습적 생검(Tissue biopsy)으로 수술 또는 가는 바늘을 통해 추출한 종양의 표본의 조직을 검사하는 방식이 주를 이루었으나, 최근에는 체액 속에 존재하는 깨진 암세포 DNA 조각을 찾아 유전자 검사로 분석하는 액체생검(Liquid biopsy)이 새로운 패러다임으로 떠오르고 있다.
액체생검을 위한 바이오마커로 순환 종양 세포(Circulating tumor cell, CTC), 순환 종양 핵산(Circulating tumor nucleic acid), 종양 유래 엑소좀 등 다양한 물질이 유망 후보로 여겨지고 있으며, 이 중 엑소좀이 세포와 동일한 지질 이중층으로 구성된 외막이 내부의 물질을 안정적으로 유지할 수 있어 가장 촉망받고 있다.
연구팀은 혈액 내 유방암 유래 엑소좀을 검출하기 위해 미세유체칩(Microfluidic chip)과 하이드로겔(Hydrogel) 구조체를 결합하고, 구조체 내부에 민감도 높은 탐침(probe)을 장착하였다. 탐침이 유방암의 바이오마커인 ErbB-2(Erythroblastic oncogene B-2 gene, 적아세포 암유전자)와 반응 시 폭발적인 형광 신호 증폭이 발생하도록 함으로써 정밀한 유방암 진단이 가능한 시스템을 개발하였다.
탐침에는 CHA(Catalytic Hairpin Assembly) 기술*을 적용하여 추가적인 첨가물이나 별도 과정 없이도 자가신호 증폭을 통해 원스텝으로도 고감도의 검출이 가능하게 하였다.
* CHA 이론 : 두 가지 준안정성을 갖는 DNA 구조체를 이용하여 효소 또는 열 조절 없이 실온에서 자가 신호 증폭을 통해 고감도의 유전자 검출이 가능한 기술
또한 항존유전자*의 일종인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 글리세르알데히드-3-인산 수소 이탈 효소)를 동시에 검출하여 표적유전자인 ErbB-2 형광신호를 보정함으로써 보다 높은 신뢰성을 가질 수 있도록 고안하였다.
* 어떠한 조건에 관계없이 모든 조직에서 일정하게 발현되고 세포의 기초 대사 활동에 관여하는 유전자
연구책임자인 임은경 박사는 “조직검사의 불편함 없이 혈액만으로 유방암을 정밀 진단할 수 있고, 특히 단일 칩 내에서 신호 보정을 통해 추가적인 과정 없이 원스텝으로 개인마다 다양한 농도로 존재하는 엑소좀 내 유방암 유전자에 대한 신뢰성 높은 분석이 가능하다”며, “향후 치료 모니터링과 전이 추적에도 활용할 수 있을 것으로 기대된다”고 밝혔다.
공동 연구책임자인 함승주 교수는 “별도 분석 장비나 전문 인력이 없이 단일 칩으로 정밀 유방암 진단을 가능하게 하는 것”이라며, “유방암 조기진단과 나아가 효과적인 암 치료전략 개발에도 기여 수 있을 것으로 기대된다”라고 덧붙였다.
연 구 결 과 개 요
□ 연구배경
○ 엑소좀은 인체 내 다양한 세포들로부터 배출되는 나노 사이즈(50-200nm)의 작은 소포체로 체액 내 고농도로 존재하며, 배출된 모세포의 특성을 가지고 있어 액체생검 분야에서 다양한 질병의 바이오마커로 각광을 받고 있다.
○ 다양한 체액(혈액, 소변, 눈물 등)에서 분리된 엑소좀은 표면의 특이적인 단백질(CD9, CD81 등)을 활용하여 엑소좀을 분석하는 연구가 다수 진행되고 있다. 하지만 환자마다 엑소좀의 수가 차이가 있기 때문에 정량적 분석만으로는 위양성 또는 위음성 결과를 초래할 수 있어 이를 보완할 수 있는 연구가 필요하다.
○ CHA(Catalytic Hairpin Assembly) 이론은 두 가지 준안정성을 갖는 DNA 구조체를 이용하여 효소 또는 열 조절 없이 실온에서 자가 신호 증폭을 통해 고감도의 유전자 검출이 가능한 기술이다.
○ 유방암의 대표적 바이오마커인 ErbB-2 유전자와, 이를 보정하기 위한 항존유전자인 GAPDH 유전자를 동시에 진단할 수 있는 미세유체 기반의 칩을 개발하였다. ErbB-2와 GAPDH 유전자 검출용 프로브를 각각 제작하고 이를 하이드로겔 구조체에 담지하여 칩 내에 안정적으로 고정하여 바이오마커를 고감도로 검출하고 이 신호를 동시에 보정할 수 있는 새로운 전략을 제안하였다.
□ 연구내용
○ 연구팀은 유방암 바이오마커인 ErbB-2 mRNA와 항존유전자인 GAPDH mRNA를 각각 검출하는 형광 신호 증폭 프로브 개발하고 이를 미세유체칩 내부에 고정하여 표적 유전자를 고감도로 검출하고 동시에 신호를 보정 할 수 있는 시스템을 개발하였다.
○ 이 연구에서 프로브를 담지한 리포솜이 고정된 하이드로겔 구조체를 개발하고 이를 미세유체칩에 고정하여 새로운 형태의 미세유체 기반 하이드로겔 센서를 개발하였다. 본 센서는 표적 유전자와 항존유전자를 동시에 분석하도록 설계되어 시료의 정보를 보다 정밀하게 분석할 수 있다.
○ 즉, 본 연구의 성과는 미세유체 기반의 엑소좀 유전자(exoNA) 검출 시스템을 개발하였으며, 특히 칩 내부에 하이드로겔 구조체는 유전자 검출 프로브를 안정적으로 고정시켜 단일 칩에서 고감도 유전자 검출과 신호 보정을 통한 정밀 진단이 가능한 시스템을 개발하였다. 기존 수술 또는 침습적 방식이 필요한 일반적인 접근법과 달리 혈액에 존재하는 엑소좀을 표적으로 유방암을 조기에 진단하고 치료 예후 모니터링하는데 적용될 수 있는 장점이 있다.
□ 연구성과의 의미
► 전임상에서 유방암 진단 기술 : 유방암 조기 진단 및 예후 모니터링에 활용
○ 본 연구는 전임상 단계에서 유방암의 조기 진단과 예후 모니터링을 위해 기존의 침습적 방식이 아닌 액체생검을 통한 혈액 내 엑소좀 유전자(exoNA)를 검출할 수 있는 기술을 개발하였으며 형광 신호 증폭 프로브를 접목한 미세유체칩을 통해 추가적인 과정 없이 원스텝(one-step)으로 유방암을 진단할 수 있다는 장점이 있다.
연 구 결 과 문 답
이번 성과 뭐가 다른가
1. 혈액 내 엑소좀 유전자(exoNA)를 검출하기 위해 새로운 형태의 미세유체 기반 하이드로겔 센서를 개발
어디에 쓸 수 있나
1. 액체생검을 통한 유방암 조기 진단
2. 액체생검을 통한 치료 예후 모니터링
실용화까지 필요한 시간은
본 연구결과는 유방암 진단의 상용화 전의 유효성 검증에 사용되는 기술로서 인체에 직접적인 적용에는 시간이 소요되겠지만 임상적 연구는 빠른 시일 내 가능
실용화를 위한 과제는
기존 체외진단 의료기기와 마찬가지로 유효성 검증과 안정성 확보가 필요함
꼭 이루고 싶은 목표는
혈액에서 엑소좀이 완벽하게 정제 및 분리되는 미세유체칩을 개발하여 본 진단 기술과 접목하고 싶음
그림 1. 혈액 내 암 유래 엑소좀을 검출하기 위한 미세유체칩의 개략도.
미세유체칩에 결합된 exoNA 검출 하이드로겔은 내부에 형광 신호 증폭을 유발하는 프로브 세트를 통해 고감도의 엑소좀 내부 유전정보를 분석할 수 있음.
그림 2. 엑소좀 유전자(exoNA) 검출을 위한 하이드로겔 센서의 제작.
a) 엑소좀 유전자 검출을 위한 하이드로겔 센서의 구조.
b) 유전자 검출 프로브의 리포솜 담지 확인을 위한 형광현미경 관찰(이미지의 빨간색은 리포솜, 초록색은 형광 프로브를 나타냄).
c) 주사전사현미경(SEM)을 통해 하이드로겔 구조체 내부에 리포솜 고정을 확인함.
d) 리포솜과 엑소좀의 외막 분해를 위한 계면활성제(tritonX-100)의 농도를 최적화시킴.
e), f) 계면활성제 처리 전(e)과 처리 후(f)의 현미경 이미지. 리포솜 형태 관찰을 통해 계면활성제로 인해 리포솜이 분해되는 것을 나타냄.
g) 하이드로겔 센서의 형광 신호 증가. 시료의 처리 전 형광성의 변화가 관찰되지 않지만, 처리 후 형광 신호가 급격히 증가함을 확인함.
그림 3. 엑소좀 유전자 검출을 위한 하이드로겔 구조체의 최적화를 진행함.
a), b) PEG의 분량을 조절하여 하이드로겔 구조체의 투과성을 최적화하였으며,
c) 형광물질이 달린 dextran70K와 DNA를 분자 모델로 하여 투과도를 실험한 결과, 20%의 분량에서 가장 높은 투과성을 보였음(빨강;신호 높음, 파랑;신호 낮음)
d) 또한 20% PEG 분량에서 가장 높은 형광 증폭반응을 확인함.
e) 형광 이미지는 표적 유전서열 DNA를 농도별로 처리한 결과이다. 표적 DNA가 증가할수록 더 높은 양의 형광 신호가 관찰된다.
f) 100fM-1uM의 표적 DNA를 처리하여 검량 선(calibration curve)을 작성하였으며, 검출한도(limit of detection)는 58.3fM로 산출되었다.
그림 4. 전임상 수준에서 엑소좀 유전자 검출 가능성 확인.
a) 유방암 세포인 HCC1954 세포를 쥐에 이식 후 종양세포가 자라는 것을 관찰하였다.
b) 종양의 크기가 150mm3을 초과하는 지점을 임의의 S1기로 설정하고 쥐의 혈액을 채취하였다.
c) qRT-PCR을 통해 혈액에서 추출한 ErbB-2 유전자의 발현양을 종양을 이식하지 않은 대조군 비교한 결과. 종양을 가진 유방암 모델 쥐의 혈액 속 ErbB-2 유전자는 대조군에 비해 약 160배 증가한 것을 확인하였다.
d) 형광 이미지는 유방암 모델 쥐와 일반 쥐(대조군, normal) 혈액에서 추출한 엑소좀을 미세유체 기반의 센서에 주입하여 두 시간 반응 후 형광성을 확인함(위; ErbB-2,유방암의 바이오마커, 아래; GAPDH,항존유전자).
e) d)그림의 ErbB-2 검출부에서 측정된 형광을 GAPDH 검출부 형광으로 표준화시켜 두 실험군 간의 ErbB-2 유전자 발현양을 확인함(보정 값(a.u.) = 형광ErbB-2/형광GAPDH).
의학약학 한국생명공학연구원 (2021-11-25)