유전자 가위를 이용한 새로운 유전자 돌연변이 검출 기술 개발
KAIST는 생명화학공학과 박현규 교수 연구팀이 유전자 가위로 불리는 *크리스퍼(CRISPR-Cas9) 시스템에 의해서 구동되는 *EXPAR 반응을 이용해 유전자 돌연변이를 검출하는 신기술을 개발했다고 11일 밝혔다.
☞ 크리스퍼 (CRISPR-Cas9): 유전자 편집 기술로 DNA를 가위로 자르듯이 특정 부위를 자를 수 있으며, 가이드 RNA(guideRNA)와 Cas9 단백질로 구성된다. 안내자 역할을 하는 guideRNA가 특정 유전자의 위치를 찾아가는 역할을 하고, Cas9 단백질이 유전자를 잘라내는 가위 역할을 한다.
☞ EXPAR: 엑스파(Exponential amplification reaction, EXPAR) 기술은 약 30분의 짧은 반응 시간 내 최대 1억(108)배의 표적 핵산 증폭 효율을 구현함으로써, 높은 활용 가능성을 보유한 기술이다. 구체적으로, EXPAR 기술은 절단 효소 인식 염기서열(템플릿의 중심)과 표적 핵산 상보 염기서열(템플릿의 양 말단)이 수식된 템플릿과 표적 핵산의 혼성화 반응 후, 절단 효소와 DNA 중합 효소의 작용으로 인해 이중가닥 DNA 산물이 지수함수적으로 증폭되는 기술이다.
KAIST 생명화학공학과 송자연, 김수현 박사가 공동 제1 저자로 참여한 이번 연구는 영국왕립화학회가 발행하는 국제학술지 `나노스케일 (Nanoscale)'에 2021년도 15호 표지(Back cover) 논문으로 지난달 14일 선정됐다. (논문명: A novel method to detect mutation in DNA by utilizing exponential amplification reaction triggered by the CRISPR-Cas9 system, pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2021/nr/d1nr00438g#!divAbstract)
일반적으로 유전자 돌연변이를 검출하기 위해 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 이용한다. 하지만, 현재까지 개발된 유전자 돌연변이 검출기술들은 낮은 특이도, 낮은 검출 성능, 복잡한 검출 방법, 긴 검출 시간 등의 단점들을 지니고 있다.
연구팀은 이러한 현행 기술의 한계를 극복하기 위해서, 크리스퍼 (CRISPR-Cas9) 시스템을 활용해 검출 특이도를 높이고 EXPAR 등온 증폭 반응을 통해 검출 민감도를 크게 향상시켜서 표적 유전자 돌연변이를 고감도로(검출 한계: 437 aM (아토몰라, Attomolar)) 30분 이내에 검출하는 데 성공했다. 이는 기존 기술 대비 증폭효율 약 10만 배 증가, 검출 시간 약 50% 감소에 해당하는 수치다.
연구팀은 2개의 Cas9/sgRNA 복합체로 구성된 크리스퍼(CRISPR-Cas9) 시스템으로 유전자 돌연변이의 양 끝단을 절단했다. 절단된 짧은 이중 나선 유전자 돌연변이가, EXPAR 반응을 구동시키고 EXPAR 반응 생성물을 통해서 형광 신호가 발생하도록 설계함으로써 표적 유전자 돌연변이를 고감도로 매우 정확하게 검출했다.
연구팀은 이 기술을 통해서, 염색체 DNA 내 HER2와 EGFR 유전자 돌연변이를 성공적으로 검출할 수 있었다. 이러한 유전자 돌연변이는 유방암 및 폐암의 발생에 관여할 뿐만 아니라 특정 치료 약제에 대한 반응을 예측하기 위해서 대표적으로 활용되는 중요한 바이오 마커다.
박현규 교수는 "이번 기술은 CRISPR-Cas9 시스템에 크리스퍼 (CRISPR-Cas9) 시스템에 의해서 구동되는 EXPAR 반응을 이용하여 암 등 다양한 질병에 관여되는 유전자 돌연변이를 고감도로 검출함으로써, 다양한 질병을 조기 진단하고 환자 맞춤형 치료를 구현하는 데 크게 활용될 수 있다ˮ라고 이번 연구의 의의를 설명했다.
한편 이번 연구는 한국연구재단의 지원을 받아 중견연구자지원사업과 글로벌 프런티어지원사업의 일환으로 수행됐다.
□ 연구개요
1. 연구 배경
최근 몇 년 동안 세포 증식, 이동성, 세포 사멸을 조절하는 과정과 연관된 유전자 돌연변이에 의해 암의 많은 병리학적 특징이 형성되는 것이 밝혀졌다. 따라서 많은 연구자가 암 예후 및 치료 효능 예측을 위한 바이오 마커로써 특정 질병과 관련된 유전자 돌연변이를 주목하고 있다. 대표적으로, EGFR 유전자의 돌연변이는 비소세포성 폐암과 관련되어 있으며, 재발 환자에게 단일 제제 EGFR 억제제를 투여한 후 나타나는 종양 반응과 밀접한 연관성이 있다. 또 다른 예는 백혈병, 직장암, 췌장암, 폐암에서 높은 비율로 발견되는 KRAS 유전자 돌연변이이며, 이는 대장암에서 panitumumab 및 cetuximab 치료제에 대한 예후를 예견할 수 있는 중요 인자이다.
일반적으로 유전자 돌연변이를 검출하기 위해 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용한다. PCR을 통해 유전자 돌연변이를 함유한 증폭 산물을 형성하고, 이를 SSCP (single stranded conformational polymorphism), 전기영동 (Gel electrophoresis), 시퀀싱 (Sequencing)을 통해 분석한다.
한편, 온도 조절 장치를 필요로 하는 PCR 기술의 단점을 해결하여 현장 검사 (point-of-care testing, POCT) 기술에 필요한 소형화를 구현할 수 있는 대체 기술인 등온 핵산 증폭 기술들에 대한 관심이 높아지고 있다.
이러한 등온 핵산 증폭 기술을 활용하여 돌연변이 검출을 위한 여러 방법이 도입되었다. 가장 대표적인 것 중 하나로, RCA (rolling circle amplification) 기반 등온 핵산 증폭 기술이 있다. 이 방법은 표적 유전자 돌연변이를 식별하기 위해 Padlock 프로브의 양 끝단 서열과 표적 유전자 돌연변이 서열을 상보적으로 결합한 후, 원형 프로브가 형성되도록 ligation 반응을 구동한다. 그 후, 이 원형 프로브를 주형으로 RCA 반응을 촉진하여 표적 유전자 돌연변이를 검출할 수 있다. 그러나 이 방법에는 낮은 검출 성능 및 Padlock 프로브를 형성하기 위한 복잡한 전처리 단계 등 한계점을 가지고 있다.
이러한 한계점을 극복하기 위해 본 연구팀은 CRISPR-Cas9 시스템에 의해서 구동되는 EXPAR 반응을 이용하여 유전자 돌연변이를 검출하는 신기술을 개발하였다.
2. 연구 내용
CRISPR-Cas9 시스템에 의해서 구동되는 EXPAR 반응을 이용하여 유전자 돌연변이를 검출하는 신기술은 크게 두 부분으로 구성되어 있다. 첫째, 2개의 Cas9/sgRNA 복합체로 구성된 CRISPR-Cas9 시스템으로 표적 유전자 돌연변이의 양 끝단을 절단한다. 절단된 짧은 이중 나선 유전자 돌연변이가 반응 온도에서 브리딩 (breathing) 현상을 통해 단일 나선으로 분리되어, EXPAR 템플릿에 결합한다. 두번째, 절단 효소 및 DNA 중합 효소의 활성을 통해 EXPAR 반응을 촉진한다. 결과적으로 EXPAR 반응의 최종 결과물인 이중 나선에 형광물질이 결합하여 강한 형광 신호를 냄으로써, 표적 유전자 돌연변이를 고감도로 검출할 수 있다.
이러한 원리를 기반으로 우리는 HER2 유전자 돌연변이를 고감도로 (검출 한계: 437 aM) 30분 이내에 검출하는 데 성공하였다. 더 나아가, 다른 EGFR 유전자 돌연변이를 확인하여 기술의 보편적인 적용 가능성을 확인했다. 따라서 이 기술은 다양한 유전자 돌연변이를 식별하는 새로운 진단 플랫폼으로서의 역할을 수행할 수 있다.
3. 기대 효과
이 연구에서 설명된 CRISPR-Cas9 시스템에 의해서 구동되는 EXPAR 반응을 이용하여 유전자 돌연변이를 검출하는 신기술은 유전자 돌연변이 진단에 여러 장점이 있다. 첫째, 해당 기술은 매우 높은 증폭 효율을 가지고 있는 EXPAR 반응을 포함하고 있기에 표적 유전자 돌연변이를 식별하는 고감도 기술로 작용할 수 있다. 둘째, 해당 기술은 2개의 Cas9/sgRNA 복합체의 서열 특이적 절단 반응과 서열 특이적인 EXPAR 반응으로 구성되어 있기에 표적 유전자 돌연변이를 매우 높은 특이성을 기반으로 검출할 수 있다. 셋째, 해당 기술은 표적 유전자 돌연변이 서열에 따라 sgRNA를 재설계함으로써 다양한 유전자 돌연변이를 진단할 수 있는 강력한 플랫폼으로 이용될 수 있다. 따라서 해당 기술을 바탕으로 암 등 다양한 질병에 관여되는 유전자 돌연변이를 고감도로 검출할 수 있으며, 이를 통해 다양한 질병을 조기 진단하고 환자 맞춤형 치료를 구현하는데 크게 활용할 수 있다.
생명과학 KAIST (2021-05-11)
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