안정성 강화한 유전자 편집 단백질 개발
성균관대학교(총장 유지범) 김용호 교수(나노공학과) 연구팀은 약학과 현재경 교수, ㈜아임뉴런 Trung Thanh Thach 박사와의 공동연구를 통해 안정성이 향상된 유전자 편집 단백질을 개발했다. 연구팀은 이번 연구를 통해 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 기술을 개선하여, 유전자 치료에 더욱 안전하게 활용할 수 있는 길을 열었다.
CRISPR/Cas9은 RNA를 이용해 DNA를 잘라내는 기술로, 다양한 유전 질환 치료에 큰 기대를 모으고 있다. 그러나 이 기술은 단백질 크기가 크고 안정성이 낮아, 생체 내에서 사용하기 어려운 단점이 있었다. 김 교수팀은 단백질을 재설계해 이러한 문제를 해결했다.
연구팀은 구조 기반 단백질 디자인 기술과 Cryo-EM(초저온 전자현미경)*을 이용해 유전자 편집 단백질을 분석하고, 불안정한 부분을 재설계했다. 이를 통해 크기가 작으면서도 열역학적으로 안정된 유전자 편집 단백질(sdCas9)을 제작하는 데 성공했다.
* Cryo-EM(초저온 전자현미경): 시료를 유리화 동결하여 시료 내 생체분자 또는 세포를 자연에 가까운 상태로 고정하고, 이로부터 고품질의 이미지를 획득 후 일련의 전산처리 과정을 통해 3차원 구조 모델로 재구성하는 연구기법
이 단백질은 기존보다 안정성이 크게 향상되었으며, 특히 뇌와 근육처럼 약물 전달이 어려운 장기에서도 효과를 발휘할 수 있는 가능성을 보여주었다. 이번 연구는 향후 신경계 질환 및 희귀 유전 질환 치료에 중요한 기술로 자리매김할 것으로 기대된다.
성균관대 김용호 교수는 “이번 연구는 유전자 편집 기술이 실제 치료제로 사용되기 위한 중요한 발판을 마련한 것”이라며, “향후 다양한 질병 치료에 적용될 수 있을 것으로 기대된다”고 말했다.
공동연구팀의 이번 연구 성과는 국제학술지 어드밴스드 머티리얼즈(Advanced Materials)에 6월 22일 게재되었으며, 성균관대학교와 (주)아임뉴런 바이오파운드리의 협력으로 진행되었다.
연구내용 설명
논문명
Structure-Guided Engineering of Thermodynamically Enhanced SaCas9 for Improved Gene Suppression
저널명
Advanced Materials
키워드
CRISPR/Cas9(크리스퍼/카스나인), Thermostable protein engineering(열안정성 단백질 엔지니어링), Domain minimization(도메인 최소화), CRISPR interference(크리스퍼 간섭), Non-viral delivery(비바이러스성 전달)
DOI
https://doi.org/10.1002/adma.202404680
저 자
김용호 교수(교신저자/성균관대학교), 현재경 교수(교신저자/성균관대학교), 탁탓트렁 박사(교신저자/(주)아임뉴런), 강은성 박사(제1저자/성균관대학교), 김남형 박사(제1저자/성균관대학교), 임현경 박사(참여저자/성균관대학교), 전혜연 학생(참여저자/성균관대학교), 한가영 박사(참여저자/성균관대학교), 노영현 박사(참여저자/성균관대학교), 김경태 학생(참여저자/성균관대학교), 지나 힐랄 칼릴 박사(참여저자/성균관대학교), 신동선 학생(참여저자/성균관대학교), 엄길호 교수(참여저자/성균관대학교), 남지영 박사(참여저자/(주)아임뉴런), 이복수 박사(참여저자/(주)아임뉴런), 김한주 박사(참여저자/(주)아임뉴런), 서민아 교수(참여저자/성균관대학교), 이재철 교수(참여저자/성균관대학교)
1. 연구의 필요성
○ CRISPR/Cas 시스템은 RNA를 통해 DNA 서열을 인식하고 절단하는 3세대 유전자 가위로, 차세대 의학, 약학, 생물학, 생명공학 등 다양한 분야에 새로운 패러다임을 제시하고 있다. 특히, 인간 질병에 따른 병리학과 유전학의 연관성이 점차 규명됨에 따라, 안전하고 효율적인 유전자 교정 기술은 난치병 치료 및 난치성 질환에 대한 새로운 돌파구로 부각되고 있다.
○ 그러나 2012년 CRISPR/Cas 기작이 밝혀진 이후, 큰 단백질 크기, 타겟 서열이 아닌 다른 유전자를 타겟할 수 있는 오프 타겟 효과, PAM 서열에 대한 의존성 등의 한계점으로 인해 현재까지 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 치료제 개발과 임상 적용에 어려움이 있다. 특히 단백질 크기가 커서 전달 효율이 낮고, 열역학적 불안정성으로 인해 생체 내 안정성이 부족해 임상 적용에 제약이 있다.
2. 연구 내용
○ 해당 연구는 구조 기반 단백질 디자인 기술과 초저온 전자 현미경법 (Cryo-EM)을 활용해 유전자 편집 단백질의 불안정한 도메인을 재설계하여 크기는 작지만 열역학적 안정성을 가진 유전자 편집 단백질을 성공적으로 개발했다. 이 단백질은 생체 내 안정성을 크게 향상시켰으며, 기능적인 측면에서도 기존 시스템보다 우수한 성과를 보여줬다.
○ 이를 Cryo-EM을 통해 이 단백질의 구조를 원자 수준에서 분석하고, 유전자와의 결합 방식을 정밀하게 규명함으로써, 단백질의 안정성을 확인했다.
○ 특히, 본 연구에서 디자인된 유전자 편집 단백질은 유전자 간섭(interference) 시스템으로 활용하여, 인간유래 세포 뿐만 아니라 약물 전달이 힘든 장기인 뇌와 근육에서의 향상된 단백질 발현 억제 기능을 보여줌으로써, 기존 유전자 편집 기술의 한계를 극복하고, 중추신경계와 관련된 다양한 뇌 질환 및 희귀 질환에 대한 임상 응용 가능성을 높여줄 수 있는 혁신적인 결과를 보여주었다.
3. 연구성과/기대효과
○ 본 연구에서 개발된 구조 기반 단백질 설계 기술은 신경계 질환 및 희귀 질환 등 난치성 질병의 치료에 새로운 돌파구를 제시할 수 있는 중요한 기술로, 기존의 CRISPR/Cas 시스템의 한계를 극복하고 임상 적용 가능성을 크게 높였다.
○ 구조 기반 분자 동역학 계산법 및 초저온 전자현미경을 통한 구조학적 규명, 실험적 검증을 통한 단백질 정밀 설계 기술은 향후 질환 기초 연구 및 신약 개발을 위한 단백질 기반 치료제 설계에 중요한 기초가 될 것으로 기대된다.
○ 이번 연구를 통해 개발된 기술은 기존 유전자 편집 단백질의 한계를 뛰어넘는 혁신적 기술로, 특히 신경계 질환 및 희귀 질환에 대한 새로운 치료법 개발에 기여할 수 있는 잠재력을 지니고 있다. 향후 이 기술은 단백질 기반 치료제 개발뿐만 아니라 다양한 질병 연구에도 폭넓게 활용될 것으로 기대하고 있다.
▲ (그림1) 구조정보 기반 단백질 디자인 기술을 통한 재설계 방식과 초저온 전자현미경을 통한 유전자 편집 단백질 구조분석
(가)는 Cas9 단백질의 구조 정보를 기반으로 한 계산 전략을 보여주며, 단백질의 고유 DNA 인식 기능을 유지하면서도 크기가 작고 안정된 단백질로 재설계하기 위한 방법을 설명한다. 기능적 측면에서 각 도메인의 열역학적 안정성을 분석하였으며, DNA와 단백질 간의 거리 및 단백질 서열의 불안정성을 분석하였다.
(나)는 재설계된 유전자 편집 단백질을 Cryo-EM으로 분석한 결과를 보여준다. 이 분석을 통해 재설계된 단백질이 DNA 및 RNA와 결합된 구조를 원자 수준에서 관찰하였으며, 유전자와 결합하는 방식을 규명하였다.
(다)는 기존 Cas9 구조와 비교하여, 특정 도메인이 제거됨으로써 크기가 작아진 단백질의 구조적 차이를 확인할 수 있다.
(라)를 통해 재설계된 단백질이 유전자 인식 기능을 유지하고 있으며, Cas9 단백질이 원래 가지고 있던 유전자 결합 방식을 유사하게 유지하고 있음을 확인하였다. [사진=성균관대학교]
▲ (그림2) 마우스 뇌세포 타겟 전달 효율 및 유전자 억제 효과
Cas9 단백질 기반 CRISPR 간섭을 통한 유전자 억제 효과를 보여준다. (가) Control은 기존 Cas9단백질 기반 시스템을 의미하며, (나) sdCas9-KRAB-R의 경우 디자인된 Cas9을 기반으로 설계된 CRISPR 간섭 효과를 나타낸다. 뇌에 주입된 sdCas9-KRAB-R은 control 대비 5배 높은 세포 내 침투율을 보였으며, 체세포 감각 피질과 해마에서 더 높은 eGFP 발현 억제 효과를 나타냈다. 피질에서는 54.83%, 해마에서는 29.1%의 감소율을 보여, 기존 Control보다 우수한 성능을 확인했다. 또한, 주입 부위에서 염증 반응이 관찰되지 않아, 안전성 면에서도 우수함을 확인했다. [사진=성균관대학교]
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BRIC(ibric.org) Bio통신원(성균관대학교) 등록2024.10.1 4