신약개발을 위한 고성능 '인간 소장 상피 모델' 개발
한국생명공학연구원(이하 생명硏) 국내연구진은 인간 전분화능줄기세포* 유래 인간 소장 상피 모델(Small intestinal epithelium model)을 개발하였다. 인간 소장 상피 제작 기술은 2차원 직접 분화 또는 3차원 오가노이드에서 2차원 소장 상피 세포로 전환이 가능하여 활용성이 높다. 또한 인체의 장과 유사한 세포 다양성과 기능성을 가져, 소장에서의 약물 흡수 및 대사 평가가 가능한 플랫폼 기술로써 향후 신약개발에 큰 기여를 할 것으로 기대된다.
* 전분화능줄기세포 : 인간의 몸을 구성하는 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포로서, 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 역분화줄기세포(induced pluripotent stem cell)가 이에 해당됨
생명硏 손미영 박사팀(교신저자: 손미영/김장환/정초록 박사, 제1저자: 권오만 박사/정광보 UST통합과정6년차/이경륜 박사)이 수행한 이번 연구는 과학기술정보통신부와 한국연구재단의 Korea Bio Grand Challenge 사업, 산업통상자원부의 바이오산업기술개발과 3D생체조직칩 기반 신약개발 플랫폼 구축사업, 생명硏의 Research Initiative Program의 지원으로 수행되었고, 미국과학진흥회(AAAS)에서 발행하는 사이언스 어드밴시즈(Science Advances)지에 6월 2일자에 게재되었다.
(논문명: The development of a functional human small intestinal epithelium model for drug absorption, https://advances.sciencemag.org/content/7/23/eabh1586)
연구팀은 인간 전분화능줄기세포의 직접 분화 혹은 3차원 오가노이드 전환기술을 이용한 고성능 인간 소장 상피 모델을 개발하였다.
신약개발을 위해서는 약물이 우리 몸에서 순환하는 일련의 과정에 대한 분석이 중요하다. 이를 위해 후보 약물의 흡수, 분포, 대사, 배설(ADME)에 대한 약물동태 평가가 필요하다.
지금까지는 소장에서의 약물 흡수도를 평가하기 위해 절대표준(Gold Standard)으로 대장암 조직에서 유래한 장 세포를 사용하고 있지만, 인체 소장을 동일하게 구현하지 못하여, 소장에서 일어나는 약물의 흡수와 1차 대사를 평가하고 예측하는 것에 한계점이 있었다.
최근 전분화능줄기세포로부터 소장 세포로 분화시키는 기술이 보고되고 있으나, 낮은 분화도와 세포 다양성 부재로 인해 기능성이 떨어지며, 대량 증식의 어려움이 있었다.
생명硏 손미영 박사 연구팀은 기존 문제를 극복하고, 인간 소장에 존재하는 다양한 세포 구성과 기능성 구현을 위해, 소장 상피 세포 전구체*를 이용해 대량 배양 및 동결보관이 가능하게 하였고, 새롭게 발굴한 분화인자를 이용하여 높은 수준으로 인간 소장 조직을 모사할 수 있는 고성능 소장 상피 모델 개발에 성공하였다.
* 전구체(progenitor) : 줄기세포에서 부분적으로 분화가 진행된 세포로서, 전구체 단계를 거쳐 최종적인 성숙세포로 분화됨
또한, 연구팀은 환자 유래 역분화줄기세포*를 이용하여 환자 맞춤형 약물 효능 평가 시스템 개발의 가능성을 검증하였으며, 3차원 장 오가노이드를 2차원 소장 상피 세포 모델로 전환할 수 있는 기술 개발을 통해 본 모델 시스템의 범용성을 확인하였다.
* 역분화줄기세포 : 피부세포와 같이 이미 분화된 체세포를 미분화 상태로 되돌리는 역분화 과정을 통해 배아줄기세포와 같이 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지게 된 세포이며 유도만능줄기세포라고도 함
본 소장 상피 모델은 소장 조직의 기능성을 높은 수준으로 재현하였고, 신약의 약물동태학적 특성, 약물의 안정성, 대사/수송적 특성 및 임상투여용량 설정 등 신약개발에 있어 광범위한 활용 가능성을 제시하였다.
줄기세포융합연구센터 손미영 박사는 “본 연구팀의 고성능 인간 소장 상피 모델은 소장 조직을 모사할 수 있는 세계 최고 수준의 모델로 높은 정확도의 약물 흡수·대사 평가를 통해 신약의 효율을 나타내는 지표인 생체이용률(bioavailability)을 예측하고 약효 개선에 활용될 수 있다”며, “인체 조직 수준의 세포모델 개발, 대량화 기술 및 관련 평가법 개발은 향후 신약 개발 과정에 효과적으로 기여할 수 있고, 또한 본 연구팀이 이미 확보하고 있는 고기능성 3차원 장 오가노이드를 더욱 다양하게 활용하기 위한 기반 기술로도 기대된다”고 밝혔다.
연 구 결 과 개 요
□ 연구배경
○ 인체의 소장은 약물의 흡수 및 1차 대사(first-pass metabolism)가 일어나는 핵심 장기로 약물의 흡수도, 생체이용률, 효능 평가를 위해서는 높은 수준으로 인체 소장의 기능을 모사할 수 있는 장 상피 세포 모델 시스템 개발이 필요하다. 하지만, 현재 절대표준으로 사용되고 있는 장 상피 세포 모델은 낮은 기능성(다양한 약물 수송체 및 중요 약물대사효소 CYP3A4 부재)과 세포 다양성 부재로 인해 인체 모사도가 낮은 암 조직 유래 장 세포주들이다.
○ 최근 줄기세포를 이용하여 새로운 장 상피 세포 모델을 개발하려는 시도가 이어지고 있으나 낮은 분화 효율과 기능성으로 인해 인체 모사도가 떨어지는 단점이 있으므로, 분화 기법의 고도화를 통해 소장에서의 약물 흡수에 중요한 수송체(transporter) 및 1차 대사에 중요한 약물대사효소를 충분히 발현하는 새로운 장 상피 세포 분화기술 개발이 중요시 되어 왔다.
○ 3차원 장 오가노이드는 우수한 장 상피 세포 모델로써 실제 인간 장 상피 세포를 구조적, 기능적으로 높은 수준으로 모사하고 있으나, 장 오가노이드는 상피 세포와 세포 외 기질로 둘러쌓여 있는 구(球)형태로 장 상피세포가 노출되어 있는 오가노이드 내부의 내강(lumen; 소기관의 내부 공간)으로의 접근이 어렵고, 비균질성 등으로 인해 약물 평가 모델로써 활용성이 낮아 2차원 기반의 새로운 장 상피 세포 모델 시스템 개발이 지속적으로 요구되어져 왔다.
○ 분자 기전에 대한 이해를 기반으로 새로운 소장 상피 세포 분화 기법을 구축하기 위해 선행연구 결과들을 분석한 결과 특정 신호전달체계(WNT, NOTCH) 가 소장 상피 세포 분화에 가장 필수적인 것을 확인할 수 있었으며, 특히 소장 상피 세포 중 약물의 흡수와 대사에 가장 중요한 역할을 수행하는 흡수세포(enterocyte)로의 분화를 위해서는 WNT 신호의 저해와 NOTCH 신호의 활성화가 필요한 것으로 나타났다.
○ 기능성 소장 상피 세포 모델 시스템 개발은 높은 수준으로 인체를 모사하여 약물의 흡수 및 대사 평가의 정확도를 높이고, 이로 인해 약물의 효능 및 독성을 높은 수준으로 평가 및 예측함으로써 향후 신약 개발의 발전에 기여할 것으로 기대된다.
□ 연구내용
○ 본 연구팀은 새로운 분화 기법 개발을 통해 전분화능줄기세포로부터 대량 증식 및 동결보관이 가능한 소장 상피 세포 전구체 분화법을 구축하였으며, WNT 신호 저해제와 NOTCH 신호 활성제를 이용한 소장 상피 세포 전구체의 추가적인 분화 유도를 통해 고성능 소장 상피 모델을 개발에 성공하였다.
○ 고성능 소장 상피 모델은 실제 소장 상피에 존재하는 세포들과 비슷한 수준의 특이적 유전자 및 단백질 마커를 발현하며, 약물 흡수 및 대사에 중요한 효소의 활성을 나타내었으며, 장 내 대표적 분화세포인 흡수 세포(enterocyte), 배상 세포(goblet cell), 파네스 세포(paneth cell), 내분비세포(enteroendocrine cell)를 모두 포함한 소장 조직을 모사할 수 있는 세포 모델임을 검증하였다.
○ 전분화능줄기세포로부터 확립된 고성능 소장 상피 세포 모델 분화 기법은 3차원 오가오이드로부터 2차원 소장 상피 세포로의 전환 기술에 적용 가능하며, 환자 유래 역분화 줄기세포를 이용한 소장 상피 세포 분화에도 적용이 가능한 범용성이 있는 기술로 향후 환자 맞춤형 약물 평가 모델 시스템 개발이 가능한 것으로 확인되었다.
○ 고성능 소장 상피 모델은 약물의 흡수도 평가 시, 소장에서의 1차 대사를 반영할 수 있는 유일한 소장 상피 모델로써 실제 인간 소장에서의 약물 흡수도와 유사한 결과를 나타내어 차후 새로운 신약 개발 플랫폼으로써 활용될 수 있으며, 장내미생물 공배양 또는 면역세포 공배양도 가능함을 확인함에 따라 다양한 생물학적 실험에 광범위하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
□ 연구성과의 의미
▶ 새로운 고효율 신약 개발 플랫폼 제시 : 인체와 유사한 고성능 소장 상피 모델을 활용한 높은 예측률의 약물 흡수/1차 대사 평가 가능
○ 본 연구에서 개발한 고성능 소장 상피 세포 모델 시스템은 실제 인간의 소장을 높은 수준으로 모사하여 효율적인 약물의 흡수 및 1차 대사 평가가 가능함에 따라 향후 약물의 효능 (또는 독성) 평가 및 예측의 정확도를 높이고, 고효율 신약 개발 플랫폼으로 활용 가능하다.
○ 또한, 본 연구팀에서 제시한 고성능 소장 상피 세포 제작 기법은 환자 맞춤형 모델로 개발 가능하므로, 개인에 따라 최적의 약물 요법을 선택할 수 있는 평가 플랫폼으로 이용될 수 있다.
▶ 3차원 오가노이드의 활용성 증대 기술 확보 : 고기능성 3차원 인간 장 오가노이드의 특성을 보유한 2차원 소장 상피 모델로의 전환 가능
○ 본 연구에서 고성능 소장 상피 세포 분화 기술을 통해 3차원 장 오가노이드로부터 2차원 소장 상피 세포로 전환이 가능하여, 기존에 3차원이기 때문에 활용하기 어려웠던 장 오가노이드의 문제를 해결하였다.
○ 따라서, 본 연구팀이 보고한 고기능성 3차원 인간 장 오가노이드(‘18, Nature Communications)를 본 기술을 이용하여 다시 2차원으로 전환함으로써 접근성이 어려웠던 소장 내강 쪽 상피세포를 열린 구조로 만들어 주어 약물 평가, 마이크로바이옴 연구 등 다양한 분야에서 활용 가능하게 되었다.
연 구 결 과 문 답
이번 성과 뭐가 다른가
기존의 개발된 장 상피 세포 모델은 낮은 분화도 및 기능성으로 인해 약물의 흡수 및 1차 대사 평가의 정확도가 낮았고, 실험 배치(batch) 간 차이가 심하고, 대량 배양 및 동결보관이 어려움에 따라 활용에 있어 제한적이었다. 본 연구진이 새롭게 개발한 소장 상피 세포 모델은 대량 증식 및 동결보관이 가능하고, 실제 인간 소장 조직의 상피 세포를 비슷한 수준으로 모사함에 따라 넓은 활용성을 지니며, 높은 정확도로 약물의 흡수 및 1차 대사 평가가 가능하다.
어디에 쓸 수 있나
본 연구진이 개발한 소장 상피 모델은 약물의 생체이용률 평가 및 이에 따른 효능 및 독성 예측에 이용될 수 있으며, 나아가 신약 개발을 위한 플랫폼 기술로 활용이 가능하다. 또한, 환자 유래 역분화 줄기세포를 이용한 환자 맞춤형 약물 평가가 가능하며, 장내미생물 또는 면역세포와의 공배양을 통한 다양한 생물학적 연구에도 적용이 가능할 것으로 기대된다.
실용화까지 필요한 시간은
본 연구결과는 고성능 소장 상피 세포 모델을 제시하는 보고로 현재 SOP(표준작업절차서) 제작 및 실험실간 교차 검증을 통한 기술 표준화를 진행 중에 있으며, 향후 사업화 전략을 통해 표준 기술 개발 및 상용화를 추진할 계획이나, 신약 개발 과정에서 대체 시험법 개발은 기존 약물 평가 및 신약 개발 플랫폼을 넘어서는 안전성, 재현성 획득이 필요하므로 많은 소요시간이 필요할 것으로 예상된다.
실용화를 위한 과제는
소장 상피 세포 모델로써 실용화하기 위해서는 대량 증식 및 동결보관을 통해 세포를 안정적으로 공급 가능하고, 배치 간 차이 없이 항상 고기능성을 유지할 수 있는 재현성 있는 세포 배양 기술이 필요하다. 따라서, 표준화 작업을 통해 일정한 성능의 고기능성 소장 상피 세포 생산 절차 확립이 필요하고, 나아가 약물 흡수 및 대사 평가 시스템의 표준화로 확장이 필요하다. 이를 위해 향후 지속적인 연구를 통해 실용화를 위한 기술 표준화를 완성 할 계획이다.
연구를 시작한 계기는
기존의 소장 상피 세포 모델은 암 세포 유래 세포주(cell line)를 이용한 경우가 주로 사용되고 있고, 최근 들어 전분화능줄기세포를 이용한 장 상피 세포 분화 기법들이 일부 보고 되었다. 하지만, 현재까지 개발된 장 상피 세포 모델은 분화도가 낮고, 기능성이 떨어져 실제 약물 흡수 및 대사 평가에 활용하기에 한계가 있었다. 따라서, 높은 수준으로 실제 인간 소장 상피 세포를 모사하는 고기능성 장 상피 세포를 개발하여 약물의 흡수 및 대사 평가의 정확도를 높이고, 나아가 약물의 효능 (또는 독성)을 효율적으로 평가 및 예측할 수 있는 모델 시스템이 필요하다고 생각하였다.
에피소드가 있다면
본 연구팀이 개발한 소장 상피 세포 모델은 많은 연구원과 다양한 전문성을 지닌 팀 간의 협업을 통해 이루어졌다. 소장 상피 세포 모델의 다양한 특성 및 기능성을 검증하기 위해 효소 활성 측정 및 면역 염색 등 다양한 연구 방법이 필요하여 많은 연구원들이 본 연구에 참여하였으며, RNA 시퀀싱 및 데이터 분석, 약물 훕수 및 대사 평가, 전자현미경 이미징 분석, 장내 미생물 및 면역세포 공배양 등 새롭게 도전하는 실험들은 전문성을 지닌 다양한 팀과의 열띤 토론과 협업을 통해서 완료할 수 있었다. 일련의 과정들이 매순간 새로운 도전이고 위기였지만 항상 믿고 따라준 팀원들게 감사하며, 헌신적인 배려와 애착을 가지고 본 연구를 완수할 수 있게 도와 준 많은 동료 연구원들게 깊이 감사드린다.
꼭 이루고 싶은 목표는
기초연구라는 영역에서 오랫동안 머물다 보면 실용화에 대한 생각이 점점 옅어지는 측면이 있다. 본 연구를 시작하고 진행하면서 실제 약물 흡수 및 1차 대사 평가에서 기존에 가장 널리 사용하고 있는 대장암 세포주인 CACO-2 세포 모델에 비해 소장 상피 세포 모델의 우수성을 입증할 때마다 이번 연구는 기초연구를 통해 실용화에 이를 수도 있다는 기대감을 품게 되었다. 따라서, 본 연구팀의 목표는 기초연구 영역에 머무르지 않고, 기초연구를 통해 얻은 성과를 실제 실용화까지 발전시켜 보는 것이 목표다. 과정은 험난하겠지만 실용화에 성공하여 신약 개발 등 다양한 산업 분야에 작은 기여나마 할 수 있길 기원한다.
신진연구자를 위한 한마디
현대 과학이 점점 복잡해지고 고도화됨에 따라 혼자서 할 수 있는 연구는 점점 줄어들고 있습니다. 현대 과학의 발전에 발맞춰 성장하기 위해서는 팀원들과 그리고 다양한 전문가들과의 협업이 필수적입니다. 지금 시작하는 신진연구자들께서 부디 좋은 인연을 많이 만나 동료연구원들과 창의적인 협업을 많이 하길 바라며, 그로 인해 상생의 연구문화가 뿌리 내리길 바랍니다.
그림1. 인간 전분화능줄기세포 유래 맞춤형 고성능 소장 상피 분화 기술 개발
(A) 인간 전분화능줄기세포 기반 고기능성 소장 상피 세포 직접 분화 기술 모식도
(B) 환자 유래 역분화줄기세포를 이용한 고기능성 소장 상피 세포 분화 단계별 세포 형태 분석
(C) RNA sequencing 기반 소장 상피 세포 유사도 검증
(D-E) TEER(D) 및 CYP3A4 활성(E) 측정을 통한 소장 상피 기능성 검증
그림2. 3차원 인간 장 오가노이드 유래 2차원 소장 상피 세포 전환 기술 개발
(A) 3차원 인간 장 오가노이드 유래 2차원 소장 상피 세포 전환 기술 모식도
(B) 분화 단계별 세포 형태 분석
(C-D) TEER(C), CYP3A4 활성(D) 측정을 통한 소장 상피 기능성 검증
(E) 주사전자현미경 분석을 통한 미세융모 구조 확인
그림 3. 고성능 소장 상피 세포 모델 기반 약물 흡수도 평가
(A) 대표 약물 6종의 소장 상피 흡수도 평가 모델 개발
(B) 평가 모델을 이용한 기존의 대표적 소장 상피 모델 CACO-2세포주 및 실제 인간 소장 조직과의 약물 흡수도 비교 분석
그림 4. 고성능 소장 상피 세포의 생물학적 활용성 검증
(A) 소장 상피 세포-면역세포 공배양을 이용한 항원(LPS)에 의한 대식세포 이동률 측정
(B) 소장 상피 세포-장내미생물(L. Plantarum) 공배양을 이용한 미생물 부착능 분석
의학약학 한국생명공학연구원 (2021-06-08)
https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=331567