생명연, 연구원 창업 기업과 함께 유전자치료의 혁명을 이끌 초소형 크리스퍼 기술 개발
생명연 연구팀과 연구원 창업기업인 ㈜진코어가 초소형 유전자가위인 CRISPR-Cas12f1 기술 개발에 성공하여 유전자치료의 새시대를 열 것으로 기대된다.
한국생명공학연구원(이하 생명연) 유전자교정연구센터 김용삼 박사팀(교신저자: 김용삼 박사, 제1저자: 김도연, 이정미 박사; UST졸업)이 수행한 이번 연구는 과학기술정보통신부가 추진하는 생명연 ‘주요사업’, 과학기술일자리진흥원의 ‘투자연계형 공공기술사업화기업 성장지원사업’ 및 산업통상자원부의 ‘산업기술 알키미스트 프로젝트’의 지원으로 수행되었고, ‘네이처 바이오테크놀로지’ (Nature Biotechnology, IF 54.9) 9월 2일자 온라인판에 게재되었다.
(논문명: Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus, https://www.nature.com/articles/s41587-021-01009-z)
특히 생명연 김용삼 박사는 생명연의 창업지원 프로그램인 ‘KRIBB 바이오 스타트업 부스터’ 프로그램의 지원을 통해 유전자가위 기술을 활용한 유전자 치료제 개발 기업인 기술혁신형 벤처기업 ㈜진코어(대표이사 김용삼)를 창업하였다.
대표적인 크리스퍼 유전자가위인 CRISPR-Cas9 기술은 유전자 크기가 크고 바이러스(Adeno-associated virus; AAV) 전달체를 이용한 체내 전달에 어려움이 있어 유전자치료제로서의 활용도가 극히 제한적이었다.
효율적인 유전자교정 치료를 위해서는 유전자가위 유전자를 원하는 체내로 전달하는 것이 필수적이며, 이를 위해서 AAV 바이러스를 이용하는 것이 최선의 방법이다. 하지만 AAV가 전달할 수 있는 유전자의 크기가 제한(4.7 kb)되어 있어 CRISPR-Cas9 기술은 가장 대중적인 기술임에도 유전자치료제로서 한계가 있었다.
CRISPR-Cas12f1 시스템은 크기가 Cas9에 비해 1/3로 매우 작아 AAV 전달용 유전자가위로서 이상적인 특징을 지니고 있다. 하지만 유전자교정 효율이 전혀 없어 실제적인 치료제로서의 매력이 떨어진다.
연구팀은 기존의 효율이 없던 Cas12f1 시스템을 Cas9 수준의 효율로 탈바꿈시킴으로써 사이즈와 효율의 문제를 동시에 해결하였다.
자연계에 존재하는 Cas12f1 시스템은 유전자 가위로서의 유용성이 없었으나 유전자교정 효율을 Cas9 시스템 수준으로 향상시킴으로써 가장 이상적인 유전자치료제로 탈바꿈시켰다.
더욱이 크리스퍼 유전자가위의 고질적인 문제였던, 처음 의도하지 않았던 다른 유전자에 영향을 미치는 오프타겟(off-target) 문제와 관련, Cas9보다 오프타겟이 절반 이하로 발생함을 입증함으로써 유효성과 안전성을 고루 갖춘 유전자치료제를 개발하였다는 점에서 의의가 크다.
연구책임자인 김용삼 박사는 “본 연구성과는 생명연의 지원을 받아 연구원 창업 기업인 진코어와 협력해 이루어낸 성과로, 향후 유전자가위를 활용한 유전자치료의 혁명을 이끌 것으로 기대한다”며, “향후 시각장애, 근위축증, 빈혈, 암 등 다양한 유전질환 및 희귀난치 질환에 대한 혁신신약 개발에 기여할 것으로 기대되며, 또한 연구원 창업을 통한 연구원과 창업기업간의 좋은 협력 성공모델이 될 것으로 기대한다”고 밝혔다.
본 기술은 생명연과 ㈜진코어가 공동출원 후 기술가치평가를 거쳐 ㈜진코어에 기술이전 되었으며, 향후 이어질 후속 연구도 이와 같은 두 기관의 공동개발-기술이전-치료제개발의 선순환 구조 속에서 진행될 계획에 있다.
생명연은 R&D를 담당하고, ㈜진코어는 치료제 개발을 담당함으로써 두 기관의 시너지를 극대화하고 연구생태계 조성의 모범사례를 만들 것으로 기대하고 있다.
한편 생명硏은 현재 국가 바이오 창업 및 혁신성장의 허브로서 바이오분야 벤처창업 선도 역할을 수행 중이다. 기술창업 촉진과 성공률 제고를 위하여 전주기 창업지원 플랫폼인 ‘KRIBB 바이오 스타트업 부스터’를 구축·운영하여 창업 아이템 발굴에서부터 창업, 성장, 투자유치 지원까지 단계별 맞춤형 지원을 수행하고 있다.
그리고 생명硏은 창업 허브기능 강화를 위하여 2020년부터 ‘KRIBB 개방형 혁신창업제도’를 도입하고, ‘KRIBB 바이오 창업스쿨‘을 외부에 개방하여 국가 바이오 벤처창업 환경 조성에 힘쓰고 있다.
또한, 생명硏은 창업기업의 창업초기 리스크를 최소화하고 지속적인 성장을 지원하기 위하여, 액셀러레이터형 창업보육 지원체계를 구축·운영하고 있다. 2000년부터 2,970㎡ 규모의 BT특화 창업보육시설인 바이오벤처센터를 운영하여 지금까지 99개 기업이 창업보육 지원을 받았으며, 현재는 24개 기업을 창업보육 중이다.
지난 5년간(’17~’21.현재) 1,160억원의 투자유치 성과를 달성하였으며, 2020년 창업보육기업 25社는 819억원의 매출과 366명의 고용을 창출하였다.
이외에도, 생명硏은 ‘KRIBB 바이오 미래혁신선도 육성사업’과 ‘KRIBB 바이오 멘토단’ 등을 운영하여 기술혁신 뿐 아니라, 투자유치, 경영·사업화 지원이 가능한 토탈 기업지원시스템을 구축하였으며, 또한, 밀착협력 중인 바이오기업과 기술협력 파트너십을 구축하여 ‘KRIBB 바이오 혁신생태계’를 조성 운영 중이다.
생명硏 김장성 원장은 “생명硏은 앞으로 바이오벤처창업 활성화를 위하여 생명硏 내부 연구원 뿐 아니라, 외부예비창업자의 창업수요 발굴 및 지원도 강화하여 국가 바이오분야 창업의 주도적 역할을 하겠다.”며 “바이오 스타트업 성장에 필수적인 다양한 핵심요소(투자유치, 경영, 인증/인허가, 마케팅 등)에 대한 지원을 강화하여 창업 초기에 안정적인 성장기반 구축에 큰 도움이 되도록 노력하겠다” 고 말했다.
연 구 결 과 개 요
□ 연구배경
○ 박테리아의 후천적 면역 시스템을 통해 발견된 CRISPR 시스템은 유전자 교정 기술에 큰 발전을 야기하였다. CRISPR 시스템을 이용한 유전자 교정 기술은 그 편리성과 효율성을 바탕으로 기존의 유전자 교정기술에 비해 세포 및 다양한 동물 모델에서의 유전자 교정에 필요한 시간 및 비용의 단축, 외래 유전물질의 도입 없는 작물의 형질전환 등을 가능케 하였다. 또한 전 세계적으로 전임상 및 임상실험을 통해 새로운 질병 치료제로서의 가능성을 보여주고 있다.
○ 특히, CRISPR 시스템을 통한 효율적인 질병 치료제를 개발하기 위해서는 유전자 가위 유전자를 원하는 체내에 전달하는 것이 필수적이다. 체내에 유전자를 전달하는 방법 중 AAV(Adeno-associated virus)를 이용하는 방법은 높은 전달 효율과 안정성 및 낮은 면역원성/독성의 장점을 지닌다. 하지만 AAV에 삽입될 수 있는 유전자의 크기가 4.7kb로 제한이 있어 대표적인 크리스퍼 유전자 가위인 CRISPR-Cas9 기술은 유전자 치료제로 개발되기 어려움이 있다.
○ 최근 개발된 CRISPR-Cas12f1 시스템은 하나의 핵산분해 효소를 가지며 가이드 RNA와 결합하여 표적 유전자를 인식하여, 교정한다는 점이 기존의 CRISPR-Cas9 시스템과 동일하다.
○ 또한 Cas12f1은 Cas9을 비롯한, 기존의 핵산분해 효소들보다 크기가 1/3이하로 매우 작다는 장점을 지닌다. 이 특징은 AAV를 이용한 생체내로 전달이 가능하여 유전자치료제로 개발되기 유리한 조건이다. 그러나 CRISPR-Cas12f1 시스템은 동물 세포 내 유전자 교정 효율이 전혀 없어 치료제용 유전자 가위로서의 사용이 불가능하였다. 따라서 CRISPR-Cas12f1 시스템의 교정 효율 증가는 크기가 작은 장점을 지닌 새로운 유전자 교정 기술을 유전자 치료제 개발에 적용하는데 꼭 필요한 요건이다.
□ 연구내용
○ 연구팀은 초소형 CRISPR-Cas12f1 시스템의 핵심 구성물질인 가이드 RNA를 엔지니어링 함으로써 교정 효율이 없던 Cas12f1 시스템을 Cas9 이상의 효율을 갖도록 개발하였다.
○ 모든 유전자에 대해서 교정 효율이 없던 것을 최대 80% 이상의 높은 효율을 갖는 유전자가위 시스템으로 개조하였다. 자연계에 존재하는 Cas12f1의 가이드 RNA서열과 Cas12f1의 미스매치를 해결함으로써 성과를 달성할 수 있었다. 가이드 RNA 서열 중 구조적으로 불완전한 5군데를 최적화하여 Cas9 수준의 높은 교정 효율을 확보하였다. 이 과정에서 유난히 길었던 가이드 RNA의 길이를 40% 줄임으로써 치료물질로서의 적합성을 증대하였다. 또한 유전자 가위의 필수적인 문제인 오프-타겟 문제에 있어 Cas9보다 훨씬 안전함을 입증하여 뛰어난 효율성과 더불어 안전성을 동시에 갖춘 유전자 교정 기술을 개발하였다.
○ 총 88개의 유전자를 대상으로 한 대규모 검증을 통해 향상된 Cas12f1의 효율은 Cas12a(Cpf1)보다 높았으며 Cas9과 비교하여도 비슷하거나 또는 더 높은 교정효율을 보임을 입증하였다. 또한, 상대적으로 낮은 효율을 보이는 표적서열에 대해 새로운 교정 방법을 제시함으로써 광범위한 서열에 적용 가능한 기술임을 입증하였다.
○ Cas12f1 시스템의 절단부위를 밝혀냄으로써 유전자치료제로 개발되기에 유리한 특징인 높은 지속성을 입증하였다. 이 특징을 이용하여 유전병인 레베르 선천성 흑암시(Leber congenital amaurosis; LCA)와 듀센형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy; DMD)의 원인 유전자 부위를 절단하는 치료전략을 시도하였으며 현재 미국 임상중인 치료제 EDIT101보다 뛰어난 치료효율을 증명하였다.
□ 연구성과의 의미
▶ 초소형 유전자 가위 기술을 통한 유전자 치료 기술 연구 발전
○ 즉, 본 연구의 성과는 초소형 유전자 가위인 Cas12f1 시스템의 가이드 RNA를 변형하여 최초로 교정효율을 보임으로써 유효성과 안전성을 갖춘 유전자교정 기술을 개발한 데 의의가 있다. 또한 Cas12f1 시스템의 크기를 더욱 줄이고 새로운 절단부위를 입증하여 높은 효율의 유전병 치료전략을 가능하게 하였다. 그 결과, 초소형 CRISPR-Cas12f1 시스템을 고효율의 유전자교정 플랫폼 기술로 변모시켰을 뿐만 아니라, AAV 전달 방법을 이용한 유전자 치료제 개발의 가능성을 제시하고 있다.
○ 특히, 유전병의 원인부위를 절단하여 유전자의 기능을 복구시키는 전략으로 치료 가능한 시각장애, 근위측증, 빈혈 등 다양한 유전질환 치료제 개발에 크게 이바지할 것으로 기대된다.
▶ 다양한 차세대 유전자 교정 기술로 개발 가능
○ 이례적으로 작은 사이즈의 특징으로 인해 추가 도메인 융합의 여지가 존재하여, 최근 높은 정확도를 갖는 프라임 에디터(Prime editor)나 베이스 에디터(Base editor)로의 개발확대가 가능한 원천기술이다.
연 구 결 과 문 답
이번 성과 뭐가 다른가
1. 기존 가이드 RNA의 변형 및 절단을 통해 초소형 유전자 가위인 Cas12f1의 교정효율을 최초로 증명
2. 효율 뿐 아니라 안정성, 지속성 또한 높여 유전자치료제 개발에 적합한 유전자 교정 기술임을 증명
어디에 쓸 수 있나
1. 핵산분해 효소의 크기의 장점을 살려 AAV를 이용한 유전자 치료제 개발에 적용이 가능
2. 여러 도메인을 적용하여 다양한 유전자 교정기술로 개발 가능하며 이 또한 유전자 치료제 개발 가능
실용화까지 필요한 시간은
본 연구결과는 현재 국내 바이오회사 (주)진코어에 기술이전을 완료하여 여러 유전병에 적용을 통해 실용화 연구를 진행 중에 있음
실용화를 위한 과제는
국내에는 유전자가위 기반의 유전자치료제가 전무하여 비임상/전임상 허가 기준을 새롭게 마련해야하는 이슈가 존재
치료제로써의 실용화를 위해서는 단기가 아닌 장기적인 연구 지원이 필요함
연구를 시작한 계기는
유전자 치료제 개발을 위한 크리스퍼 유전자 기술을 연구하던 중 기존 기술보다 1/3크기를 갖는 Cas12f1이 소개되었으나 진핵생물에서의 유전자 교정은 증명되지 않았음. 이에 가이드RNA 서열에서 세포내 발현되기 부적합한 서열을 발견하여 이를 교정하면서 연구를 시작하였음
에피소드가 있다면
본 연구를 진행하던 중 자연계에 있는 Cas12f1을 처음 제시한 제니퍼 앤 다우드나 (Jennifer Anne Doudna)가 노벨화학상을 받음. 크리스퍼 기술이 처음 노벨상을 받음으로써 과학계 뿐만 아니라 대대적인 관심이 주목됨. 이에 힘입어 더욱더 연구에 증진하게 되었음
꼭 이루고 싶은 목표는
현재 가장 많이 사용되고 있는 Cas9 보다 본 연구의 Cas12f1 시스템이 더 다양하고 많은 분야에 적용되기 위해 Cas12f1 기술을 더 발전, 실제 유전자 치료제로 개발하여 실용화
신진연구자를 위한 한마디
본 연구성과는 지속적인 유전자가위기술을 개발하고자 하는 노력의 결과로 얻게 되었음. 연구가 순탄치 않더라도 좌절하지 않고 지속적으로 꾸준히 연구에 매진한다면 새로운 것들을 탐구하는 즐거움과 함께 좋은 결실을 얻을 수 있을 것이라 생각함
생명과학 한국생명공학연구원 (2021-09-28)