나노조립체 이용한 생체 내 분자 규모 리간드 제어 시스템 개발
고려대학교(총장 정진택) 신소재공학부 강희민-김영근 교수 연구팀이 임플란트 소재가 제시하는 리간드의 크기와 간격을 생체 내 분자 규모에서 제어하여 세포의 부착과 분극화를 조절할 수 있는 나노조립체 시스템을 개발했다.
이번 연구는 국제학술지 Advanced Materials (Impact Factor: 30.849)에 제 1저자 김유리 석박사통합과정생, 제 1저자 구명석 석박사통합과정생, 교신저자 김영근 교수, 교신저자 강희민 교수의 저자 순서로 4월 27일 게재됐다. 해당 연구는 과학기술정보통신부·한국연구재단이 추진하는 신진 연구자지원사업 및 중견연구자지원사업의 지원으로 수행됐다.
* 논문명 : Submolecular Ligand Size and Spacing for Cell Adhesion(Advanced Materials - Wiley Online Library)
세포외 기질에 있는 단백질들은 세포를 모집하거나 세포가 부착되는 정도를 조절하는 역할을 한다. 이러한 단백질 중에 RGD 리간드를 갖는 파이브로넥틴은 특히 대식세포가 염증 반응을 나타내는 M1 분극화, 재생 반응을 나타내는 M2 분극화를 조절할 수 있기에, 재생 의학 및 공학 분야에서 주목받고 있다.
* RGD 리간드: 세포 부착을 매개하게 하는 세포외 기질(Extracellular Matrix)의 단백질 중 파이브로넥틴의 아미노산 서열. 세포막에 존재하는 수용체 인테그린(integrin)은 RGD 리간드를 인지하고 세포가 부착되도록 함
* 대식세포 : 대식세포는 초기 면역 반응에서 중요한 역할을 하며, 외부 환경에 의해 M1 대식세포 또는 M2 대식세포로 분극화함. M1 대식세포는 염증성 면역 반응을 하여 몸에 침입합 세균을 방어하는 데 중요한 역할을 하며, M2 대식세포는 재생성 면역 반응을 하며 조직의 리모델링에 관여함.
연구팀은 다양한 액상환원법을 이용하여, 산화철 나노입자, 금 나노입자를 제조하고 두 소재를 복합화한 산화철-금 나노조립체를 개발했으며, 신축성 폴리머 링커를 이용하여 임플란트 소재에 나노조립체를 부착하여 대식세포의 부착과 분극화를 제어할 수 있는 시스템을 개발했다.
* 액상환원법 : 금속염을 전구체로 하여 환원제와 열을 이용하여 나노결정을 얻는 방법으로 용매 내의 금속염 농도의 과포화에 따른 핵 생성과 성장으로 나노입자를 합성하는 방법.
* 산화철-금 나노조립체 : 산화철 나노입자가 중심에 위치하고, 표면에 상대적으로 작은 금 나노입자가 일정한 크기와 간격을 가지며 붙어있는 구조로, 금 나노입자에만 반응하는 물질을 사용하여 부분적인 표면 기능화가 가능함.
나노조립체의 구성성분인 금 나노입자는 씨앗-매개 성장법을 이용하여 크기와 간격을 조절할 수 있었으며, 금 나노입자에는 RGD 리간드가 코팅되어, 결과적으로 리간드의 크기와 간격을 파이브로넥틴과 인테그린과 같은 생체 내 분자 규모에서 조절했고, 그것이 대식세포의 접착과 분극화에 미치는 영향을 확인할 수 있었다.
또한, 외부 자기장으로 임플란트 소재와 신축성 링커로 연결된 나노조립체의 거동을 조절하여, 재생성 면역 반응을 촉진할 수 있어, 생체 내 대식세포의 정밀 제어 가능성을 검증한 데 의의가 있으며, 맞춤형 환자 치료의 상용화 가능성을 제시했다.
주요내용 설명
<작성자 : 고려대학교 강희민, 김영근 교수>
< 논문명, 저자정보 >
논문명
Submolecular Ligand Size and Spacing for Cell Adhesion(wiley.com)
저 자
강희민 교수 (교신저자/고려대학교), 김영근 교수(교신저자/고려대학교), 라마사미 폴무루간 Ramasamy Paulmurugan (교신저자, Stanford University), 김유리 (공동 제1저자, 고려대학교), 구명석 (공동 제1저자, 고려대학교), 라마 땅감 (Ramar Thangam) 박사 (공동 저자, 고려대학교), 김명수 (공동 저자, 고려대학교), 장우영 교수 (공동 저자, 고려대학교 안암병원), 강나연 (공동저자, 고려대학교), 민선홍 (공동저자, 고려대학교), 김성열 (공동저자, 고려대학교), 레타오 양 (Letao Yang) 박사 (공동저자, Rutgers University), 홍현식 (공동저자, 고려대학교), 정희준 박사 (공동저자, Northwestern University), 고의관 박사 (공동저자, 한국기초과학지원연구원), 카필 파텔 (Kapil D. Patel) 박사 (공동저자, 고려대학교), 이성규 (공동저자, 고려대학교), 부홍은 (Hong En Fu) (공동저자, 고려대학교), 전유상 박사 (공동저자, 고려대학교), 박범철 박사 (공동저자, 고려대학교), 김수영 교수 (공동저자, 고려대학교), 스티브 박 (Steve Park) 교수 (공동저자, 한국과학기술원), 이준민 교수 (공동저자, 포항공과대학교), 루오 구 (Luo Gu) 교수 (공동저자, Johns Hopkins University), 김태형 교수 (공동저자, 중앙대학교), 이기범 교수 (공동저자, Rutgers University), 정웅교 교수 (공동저자, 고려대학교 안암병원)
< 연구의 주요내용 >
1. 연구의 필요성
○ 세포외 기질에 존재하는 단백질들은 세포의 모집이나 세포 모집, 세포 접착, 또는 대식세포와 같은 면역 세포들의 면역 기능을 조절하는 역할을 갖는다. 특히, 세포외 기질의 파이브로넥틴이라는 단백질은 대식세포가 염증성 면역 반응을 갖는 M1 분극화와 재생성 면역 반응을 갖는 M2 분극화를 조절하는 것으로 알려져있다. 이는 파이브로넥틴이 제시하는 아미노산 서열인 Arg-Gly-Asp, 일명 RGD라 불리는 펩타이드 서열이 대식세포의 막 단백질인 인테그린과 결합하여 세포 접착을 유도하기 때문이다. 파이브로넥틴은 여러 모듈로 구성되며, FN-III 모듈이 3 nm 수준으로 RGD 루프를 제시한다. 물리적으로 이 모듈을 6-9 nm 수준까지 늘릴 수 있으며, 이 경우에 인테그린과의 결합이 조절되는 것으로 알려져 있다. 즉, 생체 내 분자 수준에서 RGD 리간드의 크기와 간격을 조절하면 인테그린과 RGD 리간드 간의 결합을 개선 또는 방해할 수 있음을 의미하며, 이러한 생체 내 분자 규모에서의 리간드의 크기, 간격 조절 기술은 대식세포의 접착과 면역성 분극화 조절을 밝힐 수 있다.
○ RGD 리간드를 일정한 배열로 제시하는 생체소재와 대식세포 인테그린의 결합은 대식세포의 세포 골격과 단백질의 결합을 촉진하기 때문에, 대식세포가 길쭉해지며 세포 접착이 유도되어 재생반응을 갖는 M2 분극화로 이어지게 된다. 이와 반대로, RGD 리간드와 인테그린과의 결합이 방해되면 위와 같은 접착 작용이 나타나지 않아 염증반응을 갖는 M1 분극화가 나타나는 것이 여러 연구결과로 밝혀졌다. 하지만, 소재가 제시하는 RGD 리간드의 배열을 파이브로넥틴(16 nm)과 인테그린(10 nm)과 같은 생체 내 분자 규모에서 조절한 연구결과는 없었다.
○ 따라서, 세포외 기질과 대식세포 간의 상호작용을 효과적으로 모사하기 위해, 산화철 나노입자와 RGD 리간드를 제시하는 금 나노입자로 이루어진 나노조립체를 개발하여, 파이브로넥틴, 인테그린 크기 수준에서의 RGD 리간드의 크기와 간격을 조절하였고, 이와 같은 시스템은 체내에서 나타나는 대식세포의 접착과 분극화 메커니즘을 보다 심층적으로 밝힐 수 있을 것으로 기대된다.
2. 연구내용
○ 폴리올 방법을 이용하여 산화철 나노입자를 제조하였고, 수열합성, 씨앗-매개 성장법과 같은 기법으로 다양한 크기의 금 나노입자를 제조하였고, 실레인 기법을 이용해 두 나노소재를 복합화하였다. 이어서, 산화철-금 나노조립체의 금 나노입자에 세포 접착성 RGD 리간드를 코팅하여 생체 내/외에서 리간드의 크기와 간격을 생체 내 분자 수준에서 조절할 수 있는 시스템을 개발하였다.
○ 구체적으로, 나노조립체의 산화철 나노입자는 실리카 쉘을 포함하여 약 200 nm의 직경을 갖고, 금 나노입자의 직경은 7 nm, 13 nm, 20 nm로 조절하였으며, 산화철의 표면에 부착되는 금 나노입자 간의 간격은 각각 3 nm, 17 nm, 20 nm로 조절할 수 있었다. 동시에, 나노조립체가 제시하는 RGD 리간드의 총 면적을 동일하게 하여 리간드의 크기, 간격이 대식세포의 접착과 분극화에 미치는 영향을 온전히 관찰하고자 하였다.
○ 금 나노입자의 크기와 간격이 7 nm, 3 nm 인 그룹은 인테그린의 크기인 10 nm보다 인접한 위치에 RGD 리간드들이 위치하기 때문에, 대식세포는 이 그룹을 RGD 리간드가 유사-연결된 구조로 인식하게 되어 인테그린이 클러스터링 되며 대식세포의 접착이 활발하게 나타나 재생반응을 갖는 M2 분극화가 나타났다. 반면에, RGD 리간드의 크기와 간격으로 13 nm, 17 nm를 갖는 그룹은, 인접한 리간드의 간격이 파이브로넥틴의 크기인 16 nm를 초과하기 때문에 인테그린의 클러스터링이 제한되어 염증반응을 갖는 M1 분극화가 나타났다.
○ 금 나노입자의 크기와 간격이 20 nm, 20 nm 인 경우에는 하나의 금 나노입자에서 인테그린의 클러스터링이 일어나 M2 분극화가 조금 나타나는데, 외부 자기장을 인가하여 나노조립체를 기판 쪽으로 고정시킴으로써 대식세포의 접착이 향상되어 M2 분극화가 최대로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
○ 이러한 실험 결과를 바탕으로 체외 및 체내 세포 실험을 진행하며 각 그룹에서의 대식세포의 접착과 분극화의 차이를 다각도로 확인함으로써 RGD 리간드의 크기, 간격을 분자 수준에서 조절한 나노조립체는 대식세포의 접착과 더불어 M1, M2 분극화를 정밀하게 제어할 수 있음을 검증할 수 있었다.
3. 연구성과/기대효과
○ 본 연구에서 개발된 나노조립체는 RGD 리간드의 크기와 간격을 체내의 단백질 분자 수준에서 제어하여 대식세포의 접착과 분극화를 조절할 수 있음을 보여주었다.
○ 또한, 나노조립체의 거동을 외부 자기장을 이용하여 제어할 수 있어, 체내의 면역 반응을 체외에서 조절할 수 있기에, 원거리 치료에 대한 상용화 가능성을 제시하였다.
○ 본 연구에서 개발된 나노조립체가 갖는 리간드의 종류를 조절하거나 암세포, 수지상세포와 같이 다른 세포에 적용하면, 분자 규모에서 나타나는 리간드가 갖는 메커니즘을 이해할 수 있을 것으로 예상되며, 바이오 메디컬 분야에 폭넓은 연구 가능성을 제시할 수 있다.
○ 본 연구에서 사용된 리간드의 크기와 간격을 조절하기 위한 여러 기법들은 동적이고 3차원적인 리간드 배열을 갖는 나노소재를 개발하는 데에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
(그림1) 나노조립체가 제시하는 리간드의 크기와 간격에 따른 대식세포의 접착과 분극화 조절 시스템의 모식도
산화철-금 나노조립체가 제시하는 리간드의 크기와 간격을 정밀하게 제어함과 동시에 자기장을 이용하여 대식세포의 접착과 분극화를 조절할 수 있는 시스템에 대한 모식도.
제공 : 고려대학교 강희민, 김영근 교수
(그림2) 생체 내 나노조립체의 리간드의 간격과 크기에 따른 대식세포 제어 실험 결과
나노조립체가 제시하는 리간드의 크기와 간격의 조절과 자기장의 인가에 따른 마우스의 생체 내 대식세포의 접착과 분극화에 의한 실험 결과
연구 이야기
<작성자 : 고려대학교 김영근, 강희민 교수>
연구를 시작한 계기나 배경은?
면역 반응을 임플란트 소재를 활용하여 조절하는 연구는 많았으나, 세포외 기질과 세포가 갖는 단백질의 규모에서 소재를 조절한 연구가 없었기에, 이를 조절할 수 있는 새로운 연구 결과를 제시하면 면역 반응의 메커니즘을 밝히는 데에 새로운 패러다임을 제시할 수 있을 것이라 생각했습니다.
연구 전개 과정에 대한 소개
가장 중요한 연구 이슈로 삼았던 것은 나노소재가 제시하는 RGD 리간드의 총 면적은 동일하게 유지하면서 RGD 리간드의 크기와 간격을 단백질 규모에서 정밀하게 조절하는 것 이었습니다. 또한, 자기적 특성과 더불어 신축성을 갖는 폴리머를 도입하여 나노조립체의 거동을 자석을 이용하여 기판 쪽으로 끌어당길 수 있도록 하는 것이었습니다. 이러한 부분을 검증하기 위하여 합성한 나노조립체의 구조와 구성 성분를 투과전자현미경(TEM, Transmission Electron Microscopy), 자외선-가시광선 분광법(UV-VIS, Ultraviolet-Visible light spectrometry), 에너지 분산형 X-선 분광법(Energy Dispersive X-ray Spectroscopy)을 이용하여 정밀하게 분석하였습니다.이어서, 진동시편자력계(VSM, Vibrating Sample magnetometery)를 이용하여 가역적인 자기적 특성을 갖는지 확인하였고 그 이후, 원자간력현미경(AFM, Atomic Force Microscopy)을 사용하여 자석에 의해 나노조립체가 기판 쪽으로 당겨지는 것을 확인할 수 있었습니다. 또한, 나노조립체의 표면에 RGD 리간드가 기능화되는 과정을 푸리에변환 적외분광 분석법(FT-IR, Fourier Transform Infrared Spectrometry)으로 확인하였고, 또한 기판에 부착된 나노조립체가 제시하는 RGD 리간드의 면적을 주사전자현미경(SEM, Scanning Electron Microscopy)로 계산하여, 각 그룹에서 동일한 면적의 RGD 리간드를 제시하는 것을 확인하였습니다. 기판에 부착된 나노조립체가 대식세포의 접착과 분극화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 체외 세포 실험과 더불어 마우스를 이용한 생체실험을 진행하였고, 각 접착 및 분극화를 나타내는 단백질들을 염색하여 공초점 레이저 현미경 (CLSM, Confocal Laser Scanning Microscope)으로 검증하였습니다.
연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소는 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?
RGD 리간드를 제시하는 금 나노입자 간의 간격을 조절하는 것이 하나의 장벽이었습니다. 나노입자가 갖는 서로 간의 반발력으로 인해, 산화철 나노입자의 표면에 부착되는 금 나노입자 간의 간격을 5-6 nm 이하로 줄이는 것이 어려웠는데, 씨앗-매개 성장법을 이용하여 부착된 금 나노입자를 성장시켜 그 간격을 효과적으로 조절할 수 있었습니다. 성장 시간과 전구체의 양에 따라 금 나노입자의 크기와 간격을 정밀하게 조절할 수 있음을 TEM과 UV-VIS를 이용하여 검증할 수 있었습니다.
이번 성과, 무엇이 다른가?
앞서 있었던 많은 연구에서 세포의 접착에 영향을 주는 RGD 리간드를 나노소재에 도입하여 사용하고 있지만 이 반응이 실제 체내에서 나타나는 단백질 규모에서 확인한 연구는 없었습니다. 그러나 본 연구진들이 개발한 산화철-금 나노조립체는 분자 수준에서 리간드의 크기와 간격을 조절하여 체외 및 체내에서 대식세포의 접착과 분극화를 조절할 수 있음을 보여주었고, 지금까지 보고된 바 없는 획기적인 연구결과입니다.
꼭 이루고 싶은 목표나 후속 연구계획은?
기존 치료법들은 개인의 편차에 따라 부작용이 나타나거나 치료 효과가 약화되는 등의 문제가 있어, 환자 맞춤형 치료의 필요성이 대두되고 있습니다. 하지만, 아직까지의 연구들은 상용화하기에 어려운 장벽들이 많이 갖고 있습니다. 본 연구는 실제 체내에서 작용하는 단백질들의 규모를 모사하여 면역 반응을 제어할 수 있음을 보여주었고, 자기장을 이용하여 재생 반응을 촉진할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 리간드 또는 세포의 종류를 달리하여, 면역 치료 뿐만 아니라, 암세포, 수지상세포와 같은 다양한 분야에 활용해보고자 합니다. 이처럼 세포외 기질과 세포가 갖는 상호작용의 메커니즘을 정복하여 환자 맞춤형 치료가 상용화되도록 하는 것이 목표입니다.
생명과학 고려대학교 (2022-06-03)